DMP法測(cè)定漆酶酶活

A.1 原理

漆酶能氧化DMP為3，5，3’，5’-四甲氧基二苯基醌，該產(chǎn)物在470nm處有最大吸收峰，其消光系數(shù)為49.6 mmol^-1Lcm^-1，在一定濃度范圍內(nèi)該產(chǎn)物濃度與其吸光度值成線性關(guān)系，通過(guò)測(cè)定吸光度的變化值來(lái)計(jì)算產(chǎn)物的生成速率，酶活的定義為在一定條件下，每分鐘氧化1 umol DMP或生成1umol 3，5，3’，5’-四甲氧基二苯基醌所需要的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

A.2.1 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 3.5）

稱取檸檬酸14.71g，用水準(zhǔn)確稀釋至700ml，稱取磷酸氫二鈉14.33g，用水溶解并準(zhǔn)確稀釋至200 mL。將檸檬酸溶液加入到磷酸氫二鈉溶液中，邊加邊攪拌并調(diào)pH至3.5。

A.2 .2 DMP

    稱取DMP0.154g，用水溶解并定容至100mL。

A.3 儀器和設(shè)備

可見(jiàn)分光光度計(jì)

分析天平：精度為±0.0001g。

pH計(jì)：精度為±0.01 pH單位。

恒溫水?。壕?plusmn;0.2℃

A.4 步驟

漆酶酶活測(cè)定以DMP為底物，每3ml反應(yīng)體系含：2.4ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 3.5），0.5ml DMP，60 ℃保溫5 min，加入0.1ml（稀釋適當(dāng)倍數(shù)的）酶液，同時(shí)按下秒表計(jì)時(shí)，在470 nm處用可見(jiàn)分光光度計(jì)在0s時(shí)記錄一次吸光度值，記為X₀，間隔60s再記錄一次吸光值，記為X₆₀。

固體酶制劑測(cè)酶活預(yù)處理：稱取0.1g固體粉末，加1ml去離子水溶解，待充分溶解后8000rpm離心5min，取上清按上述方法測(cè)其酶活。測(cè)得酶活單位為U/ml，換算成固體酶制劑的酶活還需乘以系數(shù)10，酶活單位為U/g。

A.5 計(jì)算結(jié)果

E= ×n×7.258     …………………………………（A.1）

式中：

E：酶活力，U/ml

X₆₀：60s時(shí)記錄的吸光度值

X₀:0s時(shí)記錄的吸光度值

n：稀釋倍數(shù)

A.6 精密度

    在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)值不應(yīng)超過(guò)平均值的3%。

此方法僅作為參考，具體環(huán)境不同，相應(yīng)的也會(huì)有所不同！